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Bioquímica técnicas y métodos Legales Prólogo Índice Breve Índice La bioquímica y su estudio Introducción Como enfocar un estudio en bioquímica Niveles de investigación en bioquímica Estudios con un animal entero Estudios de órganos aislados Estudios con cultivos de tejidos y de células Estudios con orgánulos celulares Estudios moleculares Figuras Figura 1.1 Figura 1.2 Figura 1.3 Figura 1.4 Figura 1.5 Figura 1.6 Figura 1.7 Figura 1.8 Figura 1.9 Figura 1.10 Figura 1.11 Seguridad y riesgo Introducción Normas de seguridad Productos químicos Etiquetado Almacenamiento Medidas de seguridad personales. Comportamiento del investigador Fuentes de peligro en el laboratorio Investigaciones con productos radiactivos Investigaciones con microorganismos patógenos Normas GLP: the good laboratory practices Figuras Figura 2.1 Figura 2.2 Figura 2.3 Figura 2.4 Figura 2.5 Figura 2.6 Figura 2.7 Figura 2.8 Figura 2.9 La metodología analítica Introducción Fundamento de los métodos de análisis bioquímicos Métodos químicos Métodos físicos Métodos enzimáticos Métodos inmunológicos Métodos de hibridación Errores de los métodos analíticos Variabilidad de los datos analíticos Errores accidentales Errores sistemáticos Valoración de los métodos analíticos Control de calidad de los resultados Selección del método de análisis Presentación de los datos Figuras Figura 3.1 Figura 3.2 Figura 3.3 Figura 3.4 Figura 3.5 Figura 3.6 Figura 3.7 Figura 3.8 Figura 3.9 Figura 3.10 Figura 3.11 Figura 3.12 Figura 3.13 Figura 3.14 Figura 3.15 Figura 3.16 Figura 3.17 Otención de muestras Introducción Muestra de sangre Recogida de muestras de sangre Punción venosa Punción arterial Punción cutánea Anticoagulantes Alteraciones en las muestras de sangre durante la conservación y el procesamiento Agentes desproteinizantes Muestra de orina Composición de la orina Recogida de muestras de orina Orina de una micción Orina de un tiempo determinado Deterioro de las muestras de orina. Conservantes Figuras Figura 4.1 Figura 4.2 Figura 4.3 Figura 4.4 Figura 4.5 Figura 4.6 Figura 4.7 Figura 4.8 Figura 4.9 Técnicas espectrofotométricas y fluorimétricas Introducción Espectrofotometría La Luz Distribución de la energia en los átomos y en las moléculas Distribución de la energía en los átomos Distribución de la energía en las moléculas Absorción de la radiación Emisión y absorción atómica Absorción molecular. Regiones ultravioleta y visibles Absorciometría molecular. Ley de Beer-Lambert Técnicas de Fluorescencia molecular Figuras Figura 5.1 Figura 5.2 Figura 5.3 Figura 5.4 Figura 5.5 Figura 5.6 Figura 5.7 Figura 5.8 Figura 5.9 Figura 5.10 Figura 5.11 Figura 5.12 Figura 5.13 Figura 5.14 Figura 5.15 Figura 5.16 Figura 5.17 Figura 5.18 Figura 5.19 Figura 5.20 Figura 5.21 Figura 5.22 Figura 5.23 Figura 5.24 Figura 5.25 Figura 5.26 Figura 5.27 Figura 5.28 Técnicas radioquímicas Introducción Tipos de radiactividad Partículas Partículas ߯ Positrones ß(+) Captura electrónica Rayos y Desintegración radiactiva Unidades de radiactividad Detección y medición de la radiactividad Contadores Geiger-Müller Contadores de centelleo Contadores de centelleo sólido Contadores de centelleo líquido Autorradiografía Figuras Figura 6.1 Figura 6.2 Figura 6.3 Figura 6.4 Figura 6.5 Figura 6.6 Figura 6.7 Figura 6.8 Figura 6.9 Figura 6.10 Figura 6.11 Figura 6.12 Figura 6.13 Métodos de determinación de bioelementos Introducción Tratamiento de las muestras para la determinación de metales y elementos traza Métodos de determinación de biolelementos Determinación de calcio Determinación de fósforo Determinación de sodio y potasio Determinación de hierro Figuras Figura 7.1 Figura 7.2 Figura 7.3 Figura 7.4 Métodos de determinación de aminoácidos Introducción Estructura de los aminoácidos Métodos químicos para la determinación de aminoácidos totales Método de la ninhidrina Reacción de Sanger Reacción del fenilisotiocianato Método del o-ftaldehído Reacción de la fluorescamina Reacción del cloruro de dansilo Métodos químicos para la determinación de aminoácidos individuales Figuras Figura 8.1 Figura 8.2 Figura 8.3 Figura 8.4 Figura 8.5 Figura 8.6 Figura 8.7 Figura 8.8 Figura 8.9 Figura 8.10 Figura 8.11 Figura 8.12 Técnicas de separación: cromatografía Introducción Principio de las técnicas de separación. técnicas físicas Polaridad Volatilidad Solubilidad Adsorción Carga Tamaño Diseño de las técnicas de separación de moléculas Técnicas cromatográficas Técnicas cromatográficas basadas en la polaridad Cromatografía líquido-sólido de adsorción Cromatografía gas-líquido: GLC Cromatografía líquido-líquido. cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) Cromatografía de intercamibio iónico Cromatografía de permeabilidad. Cribado molecular Figuras Figura 9.1 Figura 9.2 Figura 9.3 Figura 9.4 Figura 9.5 Figura 9.6 Figura 9.7 Figura 9.8 Figura 9.9 Figura 9.10 Figura 9.11 Figura 9.12 Figura 9.13 Figura 9.14 Figura 9.15 Figura 9.16 Figura 9.17 Figura 9.18 Figura 9.19 Figura 9.20 Figura 9.21 Figura 9.22 Figura 9.23 Figura 9.24 Figura 9.25 Métodos de determinación de aminoácidos individuales Introducción Determinación de aminoácidos por TLC Separación unidimensional Separación bidimensional Determinación de aminoácidos por TLC con reacciones múltiples Separaciones de aminoácidos derivatizados Cromatografía de DNP-aminoácidos Cromatografía de dansil-aminoácidos Determinación de aminoácidos por HPLC Ejemplo de determinación de aminoácidos individuales libres por HPLC: Pico-Tag Analizadores automáticos de aminoácidos Figuras Figura 10.1 Figura 10.2 Figura 10.3 Figura 10.4 Figura 10.5 Figura 10.6 Figura 10.7 Figura 10.8 Figura 10.9 Figura 10.10 Figura 10.11 Figura 10.12 Figura 10.13 Figura 10.14 Figura 10.15 Métodos de determinación de proteínas Introducción Estructura de las proteínas Fuerzas determinantes de la estructura proteica Fuerzas electroestáticas Puentes de hidrógeno Fuerzas hidrofóbicas Fuerzas de Van der Waals Puentes disulfuro Desnaturalización de las proteínas Métodos generales de cuantificación de proteínas Método de Kjeldahl (determinación del contenido en nitrógeno) Método del biuret Método de Lowry Método del BCA Método de Bradford Nefelometría Determinación de albúmina Determinación de hemoglobina Figuras Figura 11.1 Figura 11.2 Figura 11.3 Figura 11.4 Figura 11.5 Figura 11.6 Figura 11.7 Figura 11.8 Figura 11.9 Figura 11.10 Figura 11.11 Figura 11.12 Figura 11.13 Figura 11.14 Figura 11.15 Figura 11.16 Figura 11.17 Figura 11.18 Figura 11.19 Técnicas de separación: electroforesis Introducción Fundamento de la electroforesis Componentes de un sistema electroforético Migración electroforética Naturaleza de los componentes a separar Campo eléctrico Tampón Soporte Tipos de electroforesis Electroforesis en papel de filtro Electroforesis en membranas de acetato de celulosa Electroforesis en geles de almidón Electroforesis en geles de agarosa Electroforesis en geles de policrilamida Visualización y cuantificación de los resultados Aplicaciones particulares de la electroforesis Isoelctroenfoque Electroforesis en gel de policrilamida con SDS: SDS-PAGE Electroforesis en gradiente Electroforesis bidimensional Electroforesis capilar (CE) Figuras Figura 12.1 Figura 12.2 Figura 12.3 Figura 12.4 Figura 12.5 Figura 12.6 Figura 12.7 Figura 12.8 Figura 12.9 Figura 12.10 Figura 12.11 Figura 12.12 Figura 12.13 Figura 12.14 Figura 12.15 Figura 12.16 Figura 12.17 Técnicas enzimáticas Introducción Enzimas Especificidad de acción y de sustrato` Estructura de las enzimas Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Significado de las constantes cinéticas del modelo Michelis-Menten: Km y V max Clasificación de las enzimas Diseño de la medida de la actividad enzimática Medio de reacción Medida de la velocidad de reacción Detección del sustrato o del producto de una reacción enzimática Las enzimas como reactivos Figuras Figura 13.1 Figura 13.2 Figura 13.3 Figura 13.4 Figura 13.5 Figura 13.6 Figura 13.7 Figura 13.8 Figura 13.9 Figura 13.10 Figura 13.11 Figura 13.12 Figura 13.13 Figura 13.14 Figura 13.15 Figura 13.16 Figura 13.17 Técnicas inmunoquímicas Introducción Anticuerpos Obtención de anticuerpos policlonales y monoclonales Interacciones antígeno-anticuerpo Técnicas analíticas inmunoquímicas Reacciones de precipitación Inmunoprecipitación en solución Inmunoprecipitación en gel Ensayos inmunoquímicos que utilizan marcadores Radioinmunoensayos (RIA) y ensayo inmunoradiométrico (IRMA) Inmunoensayo enzimático (EIA): Marcaje con ezimas Fluoroinmunoensayo Western Blot Figuras Figura 14.1 Figura 14.2 Figura 14.3 Figura 14.4 Figura 14.5 Figura 14.6 Figura 14.7 Figura 14.8 Figura 14.9 Figura 14.10 Figura 14.11 Figura 14.12 Figura 14.13 Figura 14.14 Figura 14.15 Figura 14.16 Figura 14.17 Figura 14.18 Figura 14.19 Figura 14.20 Figura 14.21 Figura 14.22 Figura 14.23 Figura 14.24 Métodos de determinación de proteínas individuales Introducción Técnicas de separación de proteínas Cromatografía de proteínas Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de cribado molecular Cromatografía de afinidad Electroforesis de proteínas Electroforesis en papel de filtro Electroforesis en acetato de celulosa Electroforesis en geles de agarosa Electroforesis en geles de policrilamida Técnicas de cuantificación de proteínas específicas Determinación en clínica de enzimas plasmáticas Enzimas de baja concentración Transaminasas Lactato deshidrogenasa Determinación de proteínas por técnicas inmunoquímicas Determinación de insulina por ELISA en sándwich Determinación de la proteína UCP1 por ELISA competitivo Determinación de la proteína UCP1 por Western blot Figuras Figura 15.1 Figura 15.2 Figura 15.3 Figura 15.4 Figura 15.5 Figura 15.6 Figura 15.7 Figura 15.8 Figura 15.9 Figura 15.10 Figura 15.11 Figura 15.12 Figura 15.13 Figura 15.14 Figura 15.15 Figura 15.16 Figura 15.17 Figura 15.18 Figura 15.19 Figura 15.20 Figura 15.21 Figura 15.22 Figura 15.23 Figura 15.24 Métodos generales de determinación de lípidos Introducción Clasificación y estructura de los lípidos Lípidos simples Lípidos complejos Lipoproteínas plasmáticas Determinación de lípidos Obtención y preparación de las muestras Métodos de extracción de lípidos Cuantificación de lípidos totales Determinación de glicerol Determinación de triacilgliceroles Métodos químicos para la determinación de triacilgliceroles Métodos enzimátiocos para la determinación de triacilgliceroles Determinación de ácidos grasos libres Determinación de colesterol Métodos químicos para la determinación de colesterol Métodos enzimáticos para la determinación de colesterol Determinación de cuerpos cétonicos Figuras Figura 16.1 Figura 16.2 Figura 16.3 Figura 16.4 Figura 16.5 Figura 16.6 Figura 16.7 Figura 16.8 Figura 16.9 Figura 16.10 Figura 16.11 Figura 16.12 Figura 16.13 Figura 16.14 Figura 16.15 Figura 16.16 Figura 16.17 Figura 16.18 Figura 16.19 Figura 16.20 Figura 16.21 Figura 16.22 Figura 16.23 Figura 16.24 Figura 16.25 Figura 16.26 Figura 16.27 Figura 16.28 Técnicas de separación: diálisis, filtración y centrifugación Introducción Diálisis Filtración Técnicas de centrifugación Fundamentos de las técnicas de centrifugación Diseño de la instrumentación para técnicas de centrifugación Tipo de rotores Tipos de centrifugación Centrifugación preparativa Centrifugación analítica Figuras Figura 17.1 Figura 17.2 Figura 17.3 Figura 17.4 Figura 17.5 Figura 17.6 Figura 17.7 Figura 17.8 Figura 17.9 Figura 17.10 Figura 17.11 Figura 17.12 Figura 17.13 Figura 17.14 Métodos de determinación de lípidos individuales Introducción Fraccionamiento de mezclas de lípidos Extracción con disolventes Extracción en columna Cromatografía en capa fina Determinación de ácidos grasos Determinación de ácidos grasos por cromatografía de gases Determinación simultánea de ácidos grasos libres y esterificados en plasma Determinación de las lipoproteínas plasmáticas Separación de lipoproteínas por ultracentrifugación Separación de lipoproteínas por electroforesis Determinación de lipoproteínas por métodos inmunológicos Determinación de fosfolípidos de membrana Figuras Figura 18.1 Figura 18.2 Figura 18.3 Figura 18.4 Figura 18.5 Figura 18.6 Figura 18.7 Figura 18.8 Figura 18.9 Figura 18.10 Figura 18.11 Figura 18.12 Figura 18.13 Métodos de determinación de carbohidratos Introducción Estructura de los carbohidratos Monosacáridos Disacáridos Polisacáridos Métodos para la determinación de carbohidratos Preparación de las muestras Métodos químicos para la determinación de carbohidratos Métodos de reducción del cobre Reacciones con ácidos fuertes y fenoles Métodos enzimáticos para la determinación de carbihidratos Separación de mezclas de carbohidratos e identificación Cromatografía en papel y en capa fina Cromatografía de gases y HPLC Figuras Figura 19.1 Figura 19.2 Figura 19.3 Figura 19.4 Figura 19.5 Figura 19.6 Figura 19.7 Figura 19.8 Figura 19.9 Figura 19.10 Figura 19.11 Figura 19.12 Figura 19.13 Figura 19.14 Figura 19.15 Figura 19.16 Figura 19.17 Figura 19.18 Figura 19.19 Figura 19.20 Figura 19.21 Figura 19.22 Figura 19.23 Figura 19.24 Figura 19.25 Figura 19.26 Figura 19.27 Figura 19.28 Figura 19.29 Figura 19.30 Figura 19.31 Figura 19.32 Métodos de determinación de ácidos nucleicos Introducción Estructura de los ácidos nucleicos Métodos de aislamiento de ácidos nucleicos Métodos de aislamiento y purificación de ADN Métodos de aislamiento y purificación de ARN Métodos generales de cuantificación de ácidos nucleicos Determinación por espectrofotometría Método de tinción con bromuro de etidio Método del ácido diamino benzoico (DABA) para la determinación de ADN Figuras Figura 20.1 Figura 20.2 Figura 20.3 Figura 20.4 Figura 20.5 Figura 20.6 Figura 20.7 Figura 20.8 Figura 20.9 Figura 20.10 Figura 20.11 Figura 20.12 Técnicas de hibridación y PCR Introducción Proceso de hibridación Formación y separación de la doble hebra de ADN Medio de hibridación Diseño de los métodos de hibridación Preparación de las sondas: producción y marcaje Producción de sondas Tipos de marcaje Inmovilización de la muestra Hibridación y lavados Cuantificación Reacción en cadena de la polimerasa: PCR Fundamento de la PCR Diseño de las técnicas de PCR Medio de reacción Etapas de la PCR Visualización de los productos RT-PCR Figuras Figura 21.1 Figura 21.2 Figura 21.3 Figura 21.4 Figura 21.5 Figura 21.6 Figura 21.7 Figura 21.8 Figura 21.9 Figura 21.10 Figura 21.11 Figura 21.12 Figura 21.13 Figura 21.14 Figura 21.15 Figura 21.16 Métodos de determinación de ácidos nucleicos individuales Introducción Separación electroforética de los ácidos nucleicos Estudio del ADN Uso de enzimas de restricción y fingerprinting Southern blot Análisis de RFLPs Reacción en cadena de la ligasa (LCR, Ligase Chain Reaction) Secuenciación del ADN Métodos de fragmentación química Método del terminador de cadena Estudio del ARN Dot blot y Slot blot Northern blot RT-PCR Figuras Figura 22.1 Figura 22.2 Figura 22.3 Figura 22.4 Figura 22.5 Figura 22.6 Figura 22.7 Figura 22.8 Figura 22.9 Figura 22.10 Figura 22.11 Figura 22.12 Figura 22.13 Figura 22.14 Figura 22.15 Figura 22.16 Figura 22.17 Figura 22.18 Figura 22.19 Figura 22.20 Bibliografía por capítulos Índice Analítico